高溫環(huán)境是影響動(dòng)物生產(chǎn)的重要因素，易導(dǎo)致動(dòng)物熱應(yīng)激反應(yīng)，生產(chǎn)性能下降甚至熱休克死亡，給畜禽生產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。消除和緩解動(dòng)物熱應(yīng)激已成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的問(wèn)題。蛋雞體溫高、皮膚無(wú)汗腺、羽毛豐厚、產(chǎn)蛋量高、產(chǎn)熱較多，是遭受熱應(yīng)激最敏感的群體。益生菌因其具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道通透性及增強(qiáng)腸道屏障，從而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的功能，因而已成為緩解動(dòng)物熱應(yīng)激最具潛力的生物制劑之一。

  

  本研究以蛋雞熱應(yīng)激為出發(fā)點(diǎn)，探討枯草芽孢桿菌HDRaBS1緩解蛋雞熱應(yīng)激的可行性及其機(jī)制，以期為新型抗應(yīng)激生物制劑的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

 

材料與方法

 

1.1 益生菌制劑

枯草芽孢桿菌HDRaBS1（有效活菌數(shù)100億CFU/g，專利申請(qǐng)?zhí)枺?/span>201410340289.1），由武漢華大瑞爾科技有限公司饋贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

868只280日齡健康海蘭褐商品蛋雞，湖北武漢市新洲區(qū)張店養(yǎng)雞場(chǎng)提供，試驗(yàn)分組前調(diào)整雞群產(chǎn)蛋率相近（約80%）。所有蛋雞均飼喂自配的玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧。

1.3 試劑盒

雞血清內(nèi)毒素（endotoxin）、白細(xì)胞介素1（IL-1）和白細(xì)胞介素10（IL-1）檢測(cè)試劑盒，均為上海博古生物科技有限公司產(chǎn)品；PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料SYBR，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

 

1.4 試驗(yàn)分組和飼養(yǎng)管理  

試驗(yàn)選用868只280日齡健康海蘭褐商品蛋雞，隨機(jī)分成高溫組405只，益生菌組413只（添加600g枯草芽孢桿菌菌粉/1000kg），室溫組50只，每組3個(gè)重復(fù)，均飼喂玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧。其中高溫組和益生菌組的蛋雞所處環(huán)境遭受高溫應(yīng)激，溫度控制為33℃；而室溫組的蛋雞所處溫度控制26℃。飼喂時(shí)間為蛋雞產(chǎn)蛋階段，具體從280日齡開(kāi)始到300日齡結(jié)束，試驗(yàn)期為20d。試驗(yàn)期間雞群均自由采食和飲水，每天保持16h光照(05:00-21:00)，喂料2次(08:30，17:00)。

1.5生產(chǎn)性能指標(biāo)測(cè)定

生產(chǎn)性能指標(biāo)包括產(chǎn)蛋率、平均日采食量、平均蛋質(zhì)量、料蛋比、腹瀉率、破損率和死亡率。

產(chǎn)蛋率、破損率和平均蛋質(zhì)量：定點(diǎn)在16:00對(duì)試驗(yàn)各組收蛋計(jì)數(shù)并稱質(zhì)量，計(jì)算產(chǎn)蛋率、破損率和平均蛋質(zhì)量。

平均日采食量：記錄每天飼料實(shí)際消耗量，計(jì)算平均日采食量。

料蛋比(即飼料轉(zhuǎn)化率)：平均日采食量/平均蛋質(zhì)量。

腹瀉率：腹瀉的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，①不成形、液體，稀水樣判為腹瀉；②成形、軟糞判為正常。于試驗(yàn)20d時(shí)，定時(shí)觀察，并統(tǒng)計(jì)雞群腹瀉個(gè)體，則腹瀉率（%）=某組腹瀉雞數(shù)/某組總雞數(shù)×100%。

死亡率(%)：試驗(yàn)期內(nèi)某組死亡雞數(shù)/試驗(yàn)期內(nèi)某組雞群總數(shù)×100%。

1.6 血液指標(biāo)測(cè)定

血液指標(biāo)包括內(nèi)毒素、促炎癥因子IL-1和抗炎癥因子IL-10。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后（試驗(yàn)的20d），分別從高溫組、益生菌組、室溫組隨機(jī)取9只雞（即3只/重復(fù)），分別采集血液樣品，將每個(gè)重復(fù)的3個(gè)樣品混為一樣，共計(jì)3份血液樣品。采用翅下采血的方法，每只雞采集約3~4mL，迅速裝于真空促凝管中，傾斜靜置于37℃恒溫箱1h后，4℃放置2h，4℃ 3000r/min離心15min，移液器吸取血清分裝，參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)內(nèi)毒素和細(xì)胞因子等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.7 腸道屏障功能測(cè)定

1）物理屏障

由腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白基因occludin、ZO-1和JAM-A組成。試驗(yàn)20d，分別從高溫組、益生菌組、室溫組隨機(jī)取9只雞（即每個(gè)重復(fù)3只），分別采集盲腸組織樣品，將每個(gè)重復(fù)的3個(gè)樣品混合，共計(jì)3份樣品。采用頸靜脈放血的方法將雞處死，立即打開(kāi)腹腔，迅速找到盲腸，并從距離回盲交界處3cm左右的盲腸處剪取組織約0.1g左右（每只雞采樣的相對(duì)位置保持一致），浸入預(yù)先準(zhǔn)備的sampleprotector（防止RNA的降解）中，液氮研磨組織，吸取1mL TRIzol試劑充分裂解提取RNA。將提取的RNA用NanoDrop 2000測(cè)定濃度和純度均符合要求，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PrimeScriptTM RTreagentKitwith gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)完成。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，利用熒光定量PCR檢測(cè)occlu- din、ZO-1和JAM-A mRNA的表達(dá)量。熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù): 95℃預(yù)變性30s；95℃變性20s，60℃ 20s，72 ℃ 10s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線均從65℃逐步升到95 ℃。反應(yīng)體系成分按照SYBR染料說(shuō)明書(shū)的推薦量添加，最終體積控制在20μL。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均按2-△△Ct方法計(jì)算。引物設(shè)計(jì)均采用定量專用軟件PrimerExpress完成，具體引物參數(shù)見(jiàn)表1。

2）機(jī)械屏障方面

主要觀察盲腸形態(tài)結(jié)構(gòu)并統(tǒng)計(jì)絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度，分析上皮生長(zhǎng)因子EFG的基因表達(dá)情況。采集上述處死雞的盲腸中段組織約1cm2（每只雞采樣的相對(duì)位置保持一致），置于含甲醛為4%的福爾馬林溶液中固定，經(jīng)修整、沖洗、脫水、透蠟、包埋和切片（厚度為4μm）等處理步驟后,進(jìn)行常規(guī)HE染色。使用日本NikonDS-Fi1生物光學(xué)顯微鏡并結(jié)合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察、取圖和拍照，從每張組織切片測(cè)定10根完整絨毛的絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），選擇5張切片計(jì)算每個(gè)組織的平均值。檢測(cè)盲腸組織中EFG mRNA的水平，處理方法同上述1)步驟一致，其引物參數(shù)見(jiàn)表1。

表1  熒光定量PCR引物

基因	登錄號(hào)	引物序列（5'-3')	片段大小
GAPDH	NM_204305.1	F:GGAAAGTCATCCCTGAGCTGAAT R:GGCAGGTCAGGTCAACAACA	90
occludin	NM_205128.1	F:ATCGCCTCCATCGTCTACATC R:GCTGCACATGGCCAACAAG	90
ZO-1	XM_413773.4	F:TGGGCCTCACGGACTAAAAT R:GTTTGCTCCAACAAGATAGTTTGG	118
JAM-A	EF_102433.1	F:GAAAACCAACCCGTGGACAT R:GGAAGAGCCCTTCTGGAACTT	90
FGF	NM_001001292.1	F:GCCTGATAGGAAAACATGTCATG R:ACAAAAGCAAACAGGCCCTTT	103

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2003軟件初步處理后，再用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用One way ANOVA、LSD進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和多重比較,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。柱狀圖均采用GraphPadPrism5軟件繪制完成。

結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞生產(chǎn)性能的影響

蛋雞產(chǎn)蛋率、平均日采食量、平均蛋質(zhì)量和料蛋比結(jié)果（表2）表明，與高溫組相比，益生菌組在產(chǎn)蛋率、日采食量和平均蛋質(zhì)量方面分別提高了2.60%（P<0.05）、2.91%（P>0.05）和0.96%（P>0.05），但均沒(méi)有達(dá)到室溫組水平；料蛋比方面，各組之間差異不顯著（P>0.05）。腹瀉防治效果、雞蛋破損率和死亡率結(jié)果（表2）顯示，與高溫組相比，益生菌組的腹瀉率降低了36.70%，基本達(dá)到室溫組的水平；雞蛋破損率方面，益生菌組＜室溫組＜高溫組；死亡率方面；室溫組＜益生菌組＜高溫組。

表2  枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞生長(zhǎng)性能的影響

項(xiàng)目	高溫組	益生菌組	室溫組
產(chǎn)蛋率 %	80.70±0.03a	82.80±0.03b	85.96±0.05c
平均日采食量 g	88.10±6.25a	90.66±9.49a	102.00±1.51b
平均蛋質(zhì)量 g	52.18±2.62a	52.68±1.15a	58.01±1.31b
料蛋比 %	2.09±0.17	2.07±0.23	2.05±0.14
腹瀉率 %	63.02(242/384)	39.89(158/396)	34.37(11/32)
雞蛋破損率 %	0.40	0.25	0.30
死亡率 %	2.30	1.30	0.00

注：同行數(shù)據(jù)標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）,下同。

由此可見(jiàn)，日糧中添加枯草芽孢桿菌能有效改善熱應(yīng)激蛋雞的生產(chǎn)性能。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞血液指標(biāo)的影響

從表3中得知，與高溫組相比，益生菌組和室溫組血清中內(nèi)毒素水平分別降低37.41%（P>0.05）和58.50%（P<0.05）；IL-1水平分別降低20.98%（P<0.05）和32.66%（P<0.05）；IL-10水平分別升高41.05%（P>0.05）和312.96%（P<0.05）。

表3  枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞血液指標(biāo)的影響

項(xiàng)目	高溫組	益生菌組	室溫組
內(nèi)毒素（EU/mL）	1.47±0.24a	0.92±0.23ab	0.61±0.10b
白細(xì)胞介素1（pg/mL）	190.07±12.28a	150.19±12.99b	128.00±8.00b
白細(xì)胞介素10（pg/mL）	3.24±1.15a	4.57±2.04a	13.38±3.95b

結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可降低血清中內(nèi)毒素和促炎癥因子IL-1含量，升高抗炎癥因子IL-10含量，從而能有效改善導(dǎo)致蛋雞熱應(yīng)激的核心因子。

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞腸道屏障的影響

物理屏障方面：

圖1顯示，與高溫組相比，飼喂該枯草芽孢桿菌能顯著提高盲腸組織中occludin和ZO-1mRNA表達(dá)水平，其中ZO-1的改變已顯著超過(guò)室溫組水平，但對(duì)JAM-A的表達(dá)無(wú)影響。

 

圖1  枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞盲腸緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)水平影響

綜上所述，該枯草芽孢桿菌能顯著增強(qiáng)熱應(yīng)激蛋雞的腸道物理屏障。

 

機(jī)械屏障方面:

高溫組的腸道絨毛結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重，絨毛頂端細(xì)胞脫落，發(fā)生嚴(yán)重的斷裂而導(dǎo)致固有層裸露的現(xiàn)象（圖2 A中箭頭標(biāo)示）；飼喂枯草芽孢桿菌的蛋雞腸絨毛結(jié)構(gòu)則相對(duì)較好，沒(méi)有出現(xiàn)損傷和脫落的情況（圖2 B）；而室溫下的蛋雞腸道絨毛結(jié)構(gòu)完整，走勢(shì)平直、沒(méi)有破損（由圖2 C所示,箭頭標(biāo)注位置）。從表4中得出，與高溫組相比，益生菌組和室溫組均顯著提高了盲腸絨毛高度和VH/CD（P<0.05），但各組處理對(duì)隱窩深度無(wú)顯著影響（P>0.05）。

圖2  枯草芽孢桿菌對(duì)熱應(yīng)激蛋雞盲腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

進(jìn)一步檢測(cè)該益生菌對(duì)腸黏膜修復(fù)基因EGF mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示益生菌組能顯著上調(diào)盲腸組織中EGF mRNA的表達(dá)量（P<0.05，圖3）。 綜上所述，添加該枯草芽孢桿菌能顯著改善熱應(yīng)激蛋雞的腸道機(jī)械屏障。

討論

  與哺乳動(dòng)物相比，雞消化道較短，成年雞的消化道長(zhǎng)約1.5m，其中大腸僅有3~4cm長(zhǎng)。但與哺乳動(dòng)物不同的是，雞有成對(duì)的盲腸，是微生物活動(dòng)的最大“器官”，長(zhǎng)約3~5cm。盲腸是雞的重要“器官”，關(guān)于益生菌對(duì)盲腸腸道菌群影響的相關(guān)機(jī)制研究已較為深入，但從盲腸方面開(kāi)展益生菌緩解雞熱應(yīng)激效果的研究卻是一片空白。 本文針對(duì)蛋雞盲腸，從腸道屏障功能、血液內(nèi)毒素和細(xì)胞因子變化等方面對(duì)枯草芽孢桿菌HDRaBS1緩解蛋雞熱應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，為今后相關(guān)研究提供了理論參考。

   研究表明，蛋雞在環(huán)境溫度21~30℃時(shí)每升高1℃，其采食量下降約1.5%；在32~38℃溫度范圍內(nèi)每上升1℃，采食量下降更多（約4.6%），其中超過(guò)32℃是雞生理功能趨于紊亂的溫度范圍，將產(chǎn)生各種非特異性應(yīng)答反應(yīng)（如發(fā)汗和急促喘息等），可認(rèn)為其已遭受熱應(yīng)激。熱應(yīng)激對(duì)蛋雞的負(fù)面影響已有研究，它能使蛋雞體溫升高，產(chǎn)蛋率和采食量降低，這與本文的研究結(jié)果一致（高溫組VS室溫組）。然而日糧中添加枯草芽孢桿菌能有效改善熱應(yīng)激蛋雞的生產(chǎn)性能，但是益生菌為什么能很好地緩解熱應(yīng)激依然是人們關(guān)注的重點(diǎn)。

  熱應(yīng)激能夠損傷腸道屏障，使大量的內(nèi)毒素侵入腸道黏膜下層，是導(dǎo)致一系列有害癥狀的核心因素。有學(xué)者詳細(xì)指出，大量的內(nèi)毒素穿過(guò)腸道屏障入侵血液，作用于產(chǎn)致熱原細(xì)胞（主要是單核-巨噬細(xì)胞），釋放出具有危害性的促炎癥因子，從而造成機(jī)體熱應(yīng)激反應(yīng)。促炎癥因子IL-1作用于機(jī)體下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫升高發(fā)熱；IL- 10是一種抗炎癥因子，其含量的升高能降低炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而在本研究中，該枯草芽孢桿菌確有顯著降低IL-1和內(nèi)毒素、升高IL-10的趨勢(shì)，但是益生菌是否形成腸道屏障來(lái)保護(hù)蛋雞免受內(nèi)毒素和炎癥因子的危害還需要進(jìn)一步證實(shí)。

  熱應(yīng)激易破壞腸黏膜的完整性和形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致機(jī)體營(yíng)養(yǎng)吸收障礙進(jìn)而導(dǎo)致生產(chǎn)性能低下，而本研究中發(fā)現(xiàn)益生菌能顯著改善因熱應(yīng)激損傷的絨毛結(jié)構(gòu)。上皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowthfac- tor，EGF），主要對(duì)腸黏膜的修復(fù)和再生有著重要作用，因此，益生菌促進(jìn)腸絨毛結(jié)構(gòu)的發(fā)育可作為機(jī)械屏障阻止毒素的入侵可能與EGF基因表達(dá)量的升高有關(guān)。緊密連接蛋白基因主要由occludin、ZO-1和JAM-A組成，其表達(dá)量的降低會(huì)增大細(xì)胞間隙的通透性。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激降低了盲腸組織中occludin、ZO-1和JAM-A基因mRNA的表達(dá)量,這可能因?yàn)閼?yīng)激時(shí)機(jī)體中ROS自由基增多，通過(guò)一系列調(diào)控介導(dǎo)鈣蛋白酶，最終導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)的降低。然而益生菌的飼喂能上調(diào)這些基因的表達(dá)，具有鞏固緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)重建的功能，這與Zhou等的研究結(jié)果一致。

  綜上所述，日糧中添加該枯草芽孢桿菌HDRaBS1能修復(fù)腸黏膜、上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，多層次地增強(qiáng)熱應(yīng)激蛋雞的腸道屏障功能，阻止機(jī)體內(nèi)毒素入侵血液，從而降低促炎癥因子IL-1、升高抗炎癥因子IL-10含量，從根本上緩解蛋雞熱應(yīng)激癥狀。